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均相荧光免疫分析

均相 FIA在抗原抗体反应完成后,无需将已结合和游离的标记物加以分离,可以直接进行测定。均相法常利用荧光的某些特性,如荧光的激发、吸收、猝灭等来设计试验。其中较为成功的均相FIA法有如下几种。


1)荧光激发共振能量转移免疫分析 ?在荧光激发共振能量转移免疫分析法中要采用两种标记试剂,其中一个为能量给体,另一个为能量受体。一般给体与被分析对象的标准品连接,而受体与特异性抗体连接。当发生免疫反应时两种标记物相互接近,能量从给体的电子激发态转移给受体分子。这种能量转移过程不需要光子的释放,而是通过给体与受体间的偶极-偶极相互作用实现的,其结果使得免疫复合物中给体的荧光被猝灭,游离态给体的荧光保持。当加入样品时,由于竞争反应使游离态给体的浓度增加。因而所测定的荧光强度也增大

一个有效的能量转移也需要给体的发射光谱与受体的吸收光谱有很好的重叠。SyvaAdvanceTM?荧光测定仪可用于这种体系的自动分析。该法在药物激素及蛋白质的分析方面有很多用途。在许多应用中荧光素被选作能量的给体罗丹明被用作能量的受体。4,5-二甲氧基荧光素类化合物的光谱性质非常适合于作能量受体,因为它与荧光素有很好的光谱重叠,同时自身又没有荧光。在这种情况下受体的直接激发所产生的背景荧光是可以忽略的。
? 在非竞争分析模式中,抗体的一部分用能量的给体标记。其余部分用能量受体标记,当这些抗体与多价抗原(被分析物)结合时,受体与给体相互接近而产生给体荧光猝灭
(2)荧光猝灭免疫分析(FQIA) ??在竞争型FQIA中,荧光素标记的标样(抗原)用作示踪剂。示踪剂和被分析物与特异性抗体结合时并不影响示踪剂的荧光。在免疫反应之后加入抗荧光素抗体,该抗体与游离态示踪剂结合使其荧光猝灭。由于空间阻碍,抗荧光素抗体不能和与抗体结合的示踪剂结合。因此,当样品浓度增加时体系的荧光减小。无论猝灭的效率如何,在实际应用中样品的固有荧光对总的荧光信号有很大的干扰。因而往往需要对背景进行监测和校准
(3)底物标记荧光免疫分析(SLFIA)?SLFIA属于竞争型免疫分析方法。抗原标样用荧光底物标记,如半乳糖苷伞形酮,该底物与抗原的结合物是非荧光的,它在β-D-半乳糖苷酶的存在下被水解为半乳糖和抗原与伞形酮的结合物,后者是强荧光的。这种方法的关键是:当抗体与标记抗原发生反应时酶接近荧光底物受阻。因此,只有游离态的荧光底物标记的抗原才能被酶水解释放出强荧光的伞形酮与抗原的结合物
? 比较典型的分析模式是样品中的被分析物与标记的被分析物标样竞争有限的抗体结合位点,当加入β-D-半乳糖苷酶时所产生的荧光强度与样品中被分析物的浓度成正比